Forberedende fase: I dette innledende stadiet blir et 6-karbon sukkermolekyl (vanligvis glukose) fosforylert to ganger for å danne fruktose-1,6-bisfosfat. Denne prosessen krever tilførsel av 2 ATP-molekyler og bruker enzymene heksokinase og fosfofruktokinase.
Spaltningsfase: I løpet av dette stadiet spaltes fruktose-1,6-bisfosfat til to 3-karbon sukkerarter:glyceraldehyd-3-fosfat (GAP) og dihydroksyacetonfosfat (DHAP). Disse 2 molekylene er interkonvertible, og de kan begge fortsette videre i veien.
Utbetalingsfase: Dette siste stadiet involverer konvertering av GAP og DHAP til pyruvat, og genererer ATP og NADH i prosessen. Dette stadiet består av flere enzymatiske trinn, inkludert fosforylering på substratnivå og oksidasjonsreaksjoner. Til syvende og sist produseres 2 pyruvatmolekyler sammen med totalt 4 ATP- og 2 NADH-molekyler for hvert glukosemolekyl som kommer inn i glykolyse.