I følge samtidige beretninger hadde James vært uvel i flere måneder før hans død, og led av en rekke symptomer, inkludert brystsmerter, kortpustethet og fordøyelsesproblemer. Han hadde også opplevd perioder med uberegnelig oppførsel og depresjon. Den 21. mars 1625 fikk James et alvorlig slag som gjorde at han ble lam på venstre side av kroppen. Han var verken i stand til å snakke eller bevege seg, og tilstanden hans ble raskt forverret.
James døde seks dager senere, omgitt av sin familie og rådgivere. Han ble gravlagt i Westminster Abbey 5. april 1625. Hans sønn Charles I etterfulgte ham til tronen.
Mens den eksakte dødsårsaken er ukjent, antas det at en kombinasjon av faktorer bidro til James' bortgang, inkludert hans sviktende helse, hjerneslaget og tertiansk lidelse. Noen samtidige beretninger antyder også at James kan ha blitt forgiftet, men det er ingen konkrete bevis som støtter denne påstanden.